一、实验设计

　　实验对象：罗非鱼幼鱼

　　实验基地：华东师范大学养殖基地

　　实验处理分组：共4组，如下：

　　15%普通棕亚油组(15PLC)、15%微囊棕亚油组(15PLM)

　　15%普通鱼亚油组(15FLC)、15%微囊鱼亚油组(15FLM)

　　每组3个平行，共12个桶。

　　实验样品由新奥(厦门)农牧发展有限公司提供。

　　养殖周期：从2016.07.15-2017.09.08，共8周，每天按每桶鱼总重的4%进行投喂饲料，养殖结束后采样，并进行了为期20天的嗜水气单胞杆菌攻毒实验。

　　饲料配方如下：

　　二、实验结果

　　1、微囊脂肪对罗非鱼生长和体成分的影响

　　图中，横坐标上的15PL表示饲料中添加的是15%的棕亚油，15FL表示饲料中添加的是15%的鱼亚油，黑色柱子代表的是普通油源组，而红色柱子代表的是微囊油源组，两个柱子间标注1个星号代表统计学上具有显著性差异，2个星号代表统计学上具有极显著性差异。

　　如图所示，饲料中添加微囊棕亚油与添加普通棕亚油相比，增重率、全鱼的粗蛋白和粗脂肪含量均没有显著性差异，但脏体比和脾脏指数却显著低于普通棕亚油组，脂体比有降低的趋势，但没有显著性差异。同样，饲喂微囊鱼亚油组的增重率、全鱼的粗蛋白和粗脂肪含量与普通鱼亚油组相比，均没有显著性差异，但脏体比和脾脏指数也显著低于普通鱼亚油组，脂体比也有降低的趋势，而无显著性差异。此外，我们可以看出鱼亚油组的增重率要显著高于棕亚油组，说明在15%的脂肪水平下，饲料中添加鱼亚油更有利于罗非鱼幼鱼的生长。

　　结论：不论在棕亚油组还是鱼亚油组，与普通油源相比，油源微囊化后使罗非鱼内脏团、脾脏和腹腔脂肪的重量下降，不但使鱼的状态更加健康，而且还降低了不能食用部分的比例，使更多的饲料用于肌肉生长。

　　2、微囊脂肪对嗜水气单胞菌攻毒后鱼存活率的影响

　　在8周的养殖结束后，挑选体格大小相同的罗非鱼，每条鱼注射100μl浓度为1x109 CFU/mL的嗜水气单孢菌菌液，然后每天记录死亡个数。横坐标代表的是注射菌液后的存活天数，纵坐标表示的是存活率。图a反应的是棕亚油组的存活率，图b反应的是鱼亚油组的存活率，红色线代表饲料中添加的是微囊油源，黑色线代表饲料中添加的是普通油源。

　　如图所示，不论是棕亚油组还是鱼亚油组，添加微囊油源组的死亡速度和死亡数量均显著低于普通油源组，充分说明油源微囊化之后可以提高罗非鱼的免疫力来抵抗病菌的感染，从而提高其在病害发生时的存活率。此外我们也可以看出鱼亚油组的存活率总体上均高于棕亚油组，说明添加鱼亚油可增强罗非鱼的抗病力，这可能与鱼亚油中富含多不饱和脂肪酸有关。

　　结论：不论在棕亚油组还是鱼亚油组，与普通油源相比，油源微囊化后可以提高罗非鱼的免疫力来抵抗病菌的感染，从而提高其在病害发生时的存活率。

　　3、微囊脂肪对不同组织中免疫相关酶活性的影响

　　根据上面的表型，我们推测饲料中添加微囊油源可能会影响鱼体的免疫系统。所以我们测定了血清、肝脏、脾脏、肠道四种组织中与免疫相关的三种酶的活性。

　　溶菌酶具有抗菌、消炎和抗病毒等作用，主要通过破坏细菌细胞壁，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂而使细菌溶解。酸性磷酸酶和碱性磷酸酶都是巨噬细胞溶酶体的标志酶，参与动物体内的免疫活动，其活性升高往往暗示着相关疾病的发生。

　　如图所示，与普通棕亚油组相比，棕亚油微囊后，血清、肝脏、脾脏和肠道四种组织中的酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性总体上均下降，说明饲喂微囊后的棕亚油可以减少机体内炎症的发生，使鱼体更加健康。在微囊鱼亚油组中， 酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性只有在肠道中才显示出极显著下降趋势，而在其他组织中无显著性差异，这可能与不同组织之间的特异性或鱼亚油本身拥有的抗炎功能有关。不论是棕亚油还是鱼亚油，微囊组的溶菌酶活性在血清、肝脏和脾脏中总体上均呈现下降趋势，而有文献表明溶菌酶的活性与细菌的数量成正比，说明饲喂普通油源组的鱼体内的细菌有可能更多。但在肠道组织中微囊组的溶菌酶活性却显著性升高，有文献显示，肠道中的溶菌酶可以吞噬有害菌而保留有益菌，使肠道更加健康，增强机体抵抗力。综上所述，微囊油源可以减少鱼体各个组织中炎症的发生，增强鱼体的免疫力。

　　结论：不论在棕亚油组还是鱼亚油组，油源微囊化后可以调节组织中与免疫相关的3种酶活，尤其是提高了肠道中溶菌酶的活性，使肠道状态更加健康，增强了实验鱼整体的免疫力。

　　4、微囊脂肪对丙二醛含量和抗氧化基因表达的影响

　　因为饲喂的为高脂饲料，所以我们检测了血清和肝脏中丙二醛(MDA)的含量，MDA是体内氧自由基攻击生物膜中的多价不饱和脂肪酸引发过氧化作用的最终产物，其含量高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度和机体受氧化损伤的程度，结果发现微囊棕亚油组的血清和肝脏中MDA的含量均低于普通棕亚油组，说明棕亚油在微囊后可减少组织中脂质过氧化物的积累，减少了机体的氧化损伤，保护了生物膜系统。超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是鱼体中重要的抗氧化酶类，可清除机体代谢中产生的自由基和过氧化氢(H2O2)。我们测定了不同处理下肝脏、脾脏和肠道三种组织中编码GSH-PX基因的表达量和肝脏中SOD的活性，但结果显示均无太大的差异，可能是鱼体已经适应了这种高脂的状态，所以酶活和基因的表达量上没有太明显的变化。

　　结论：棕亚油微囊化之后可减少组织中丙二醛的积累，减少长期摄入高脂饲料对鱼体造成的氧化损伤。

　　5、棕亚油微囊化后对其脂毒性和组织中炎症因子表达量的影响

　　大量文献表明棕亚油中的棕榈油具有一定的脂毒性，大量食用会增加机体的氧化应激和炎症因子的表达。白细胞介素1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF-α)是体内重要的炎症因子，它们的含量与机体炎症反应的发生息息相关。从结果可以看出，普通棕亚油组中炎症因子的表达量均高于富含多不饱和脂肪酸的鱼亚油组，而棕亚油微囊后,机体最重要的免疫器官脾脏中两种炎症因子基因的表达量均显著性的下降，而且肠道中IL-1的表达量也显著性下降，几乎与鱼亚油组齐平，说明棕亚油微囊后可降低其脂毒性并减少鱼体内炎症因子的表达。

　　结论：与普通棕亚油相比，棕亚油微囊化后可降低其自身的脂毒性并减少鱼体内炎症因子的表达，使机体更加健康。

　　6、棕亚油微囊化后对机体应激和细胞凋亡的影响

　　谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)是机体中最重要的转氨酶，在平衡机体氨基酸池以及蛋白质、脂肪与糖之间的转化中发挥着非常重要的作用，其含量升高往往代表着肝脏受损。由图可知，普通棕亚油组中AST和ALT的酶活显著高于微囊棕亚油组，说明长期投喂含15%普通棕亚油的饲料会导致鱼体发生脂肪肝和肝损伤，而棕亚油微囊化后则可减轻其导致的脂毒性。同样脂肪水平下，鱼亚油组则不会出现这种现象。热休克蛋白70(HSP70)是热应激蛋白家族中重要的组成成员，可帮助机体维持正常的新陈代谢和保护细胞的完整性，在机体遭受到应激时其表达会急剧升高。在脾脏中，普通棕亚油组HSP70的表达量显著高于微囊组，说明长期投喂普通的棕亚油会使鱼体处于一种应激的状态，不利于鱼的正常生长。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)含量的升高会促进细胞发生凋亡现象，由图可知，在脾脏和肠道中，普通棕亚油组Caspase3的表达量均显著高于微囊组，说明长期大量饲喂普通的棕亚油会诱发细胞的凋亡，这个现象在肠道中尤为明显，而棕亚油微囊化之后则会使Caspase3的表达量下降，减缓其诱导的脂毒性和细胞凋亡。

　　结论：与普通棕亚油组相比，棕亚油微囊化之后可减少机体的肝损伤和应激，并减少脾脏和肠道中的细胞凋亡的发生。

　　7、微囊脂肪对鱼肠道健康和相关基因表达的影响

　　图a左边为普通棕亚油组的肠道切片，右边为微囊棕亚油组的肠道切片，可以看出右图中肠绒毛的高度和完整度均好于左图，肠道状态更加健康，而这一现象在图b的鱼亚油组中更加明显。图c中的闭锁蛋白(Occludin)和闭合蛋白(Claudin)是肠道紧密连接蛋白中的重要组成成员，其含量的多少对肠道的通透性和屏障功能有着重要的影响。结果显示，微囊油源组中Occludin和Claudin基因的表达量均高于普通油源组,与前图其他指标相结合，可说明微囊后的棕亚油和鱼亚油可改善肠绒毛的形态，改善肠道的通透性和屏障功能，使肠道状态更加健康。

　　结论：不论在棕亚油组还是鱼亚油组，油源微囊化之后可以改善肠道的整体状态，促进营养物质的消化吸收，并增强鱼体的抗病力。

　　8、微囊油源对整体肠道菌群的影响

　　综上所述，前面的大部分指标都在肠道组织中具有显著性差异，且15%脂肪水平下，微囊油源组的存活率也显著高于普通油源组，所以我们推测微囊的油源可能是通过改变肠道微生物的组成来发挥作用。所以我们用试剂盒提取了15PLC、15PLM、15FLC和15FLM四组肠道中所有微生物的DNA，每组3个平行，共12个样品，然后送至美吉生物公司进行高通量测序，获得了不同处理肠道中微生物的所有序列信息。

　　把不同处理组中3个平行的结果求平均值，并把不同微生物按属的水平进行归类后得到图8的结果。其中图a为微生物群落的Heatmap图，可比较四个处理在属水平上微生物群落的种类和丰度，颜色越红代表该属细菌越多。由下图a可知，左边15PLM和15PLC两组虽然同为棕亚油饲喂组，但两者并没有聚类在一起，说明棕亚油在微囊后，显著影响了其原来菌群的组成。而两个鱼亚油组聚类在了一起，说明微囊技术对鱼亚油组没有太显著的影响。图b为PCA主成分分析图，一方面可以看出同一处理3个不同样品间的平行性很好，均位于同一椭圆内。另一方面从横坐标的距离上看，棕亚油15PLC和15PLM两组间的距离最远，即两者间物种组成的差异最大，说明油源微囊技术在其中发挥了重要的作用。图c为ACE指数，反应了微生物群落的丰度，可看出棕亚油微囊后，肠道中微生物群落的丰度显著性下降。图d为shannon指数，反应了微生物群落的多样性，结果发现普通棕亚油饲喂组肠道中的微生物群落多样性显著高于微囊棕亚油饲喂组，说明棕亚油微囊后，肠道中微生物群落的多样性显著性下降。图e为物种Venn图分析，结果显示，如果以属作为分类水平，15PLC共测得324种物种，远高于15PLM的219种、15FLC的205种和15FLM的225种，而且15PLC中独有的物种达到了99种，也远高于15PLM的34种、15FLC的28种和15FLM的31种，充分说明棕亚油微囊后对肠道微生物群落的组成有很大的影响。

　　结论：与普通棕亚油组相比，棕亚油微囊化后，其肠道中总微生物群落的种类和数量都显著性下降。

　　9、微囊棕亚油对肠道中功能性菌群丰度的影响

　　以属的水平进行归类，我们选取了肠道微生物群落中占比大于5%的细菌，共8种细菌，按其相对丰度作图后得到了群落柱形图a，然后又分别对棕亚油组和鱼亚油组中丰度排名前15的物种的丰度差异进行显著性分析，得到了图b和图c，一个红色星号表示微囊组与普通组之间差异显著，两个红色星号表示差异极显著，置信度为95%。

　　图a中的8种细菌分别为Bacillus(芽孢杆菌属)、Pseudoalteromonas(假交替单胞菌属)、Paenibacillus(类芽孢杆菌属)、Roseovarius(玫瑰变色菌属)、

　　Gaetbulibacter(泥滩杆菌属)、Alkaliphilus(嗜碱菌属)、Neptunomonas、Romboutsia。图a中蓝色的柱子代表芽孢杆菌属，是一种益生菌，可帮助鱼虾抵抗水环境中产毒素的真菌，促进生长，提高免疫力。由图a可知，与普通棕亚油组相比，饲喂微囊棕亚油鱼的肠道中芽孢杆菌的丰度显著性升高，说明饲喂微囊棕亚油有利于该菌在肠道中生长繁殖。同时微囊鱼亚油组中该菌的数量也呈现上升的趋势，但没有显著性差异。浅绿色柱子代表的是假交替单胞菌属，是一种可使鱼虾致病的有害菌，从图a可看出，饲喂普通棕亚油组肠道中假交替单胞菌的丰度显著性升高，而饲喂微囊棕亚油可抑制该菌在肠道中生长繁殖，同时微囊鱼亚油组肠道中该菌的数量也低于普通鱼亚油组。紫色的柱子代表类芽孢杆菌属，在鱼体内可产生多种生物活性物质和抗菌物质，是一种有益菌，油源微囊后该菌在肠道内的丰度明显升高，尤其是在棕亚油组中具有极显著性差异。而玫瑰变色菌属、泥滩杆菌属和嗜碱菌属多存在于水环境中，具体的功能还没有文献报道，这里就不再讨论了。

　　综上所述可以证明，与普通棕亚油组相比，微囊棕亚油组肠道中总微生物群落的丰度和多样性均显著性下降，使各种微生物的相对丰度不同程度的提高或降低。而且微囊棕亚油还可以提高肠道中有益菌的数量，降低有害菌的数量，使肠道处于更加健康的状态。与微囊棕亚油组类似，微囊鱼亚油组也有相同的趋势，但效果却没有微囊棕亚油组那么明显。

　　结论：棕亚油微囊化之后，肠道中有益菌的数量增加，有害菌的数量减少，使肠道内环境更加健康。